基于靶标和荧光技术的先导化合物高通量筛选实例探析

高通量药物筛选技术(High throughput screening，HTS)是20世纪80年代后期发展起来的一种用于新药研发中的高新技术，它是在传统的筛选技术基础上，以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据。以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转^[1]。

高通量药物筛选分析技术很多，可以分为荧光分析法、放射性法和化学发光法等^[2]。荧光分析法的优点包括价格相对便宜，无放射性标记，安全性好，可重复性好及容易处理，特别是近年来荧光物质的标记技术和荧光检测技术的突破性进展使荧光分析法在HTS中的应用日益广泛。荧光分析法主要包括荧光强度分析法、荧光偏振法、荧光共振能量转移法、荧光极化、荧光关联光谱法。现对前三种方法在先导化合物筛选的应用实例进行探析。

1荧光强度分析

依据荧光强度的变化进行检测，如荧光生成检测法中反应后荧光强度增加；在荧光淬灭检测法中，荧光强度减弱。该方法操作简便，适于微量化。

曹鸿鹏等^[3]以中国分离的甲、乙型流感病毒制备神经氨酸酶，以有荧光特性的化合物为酶反应底物，建立了适合高通量筛选神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。试验过程主要包括流感病毒神经氨酸酶的制备，米氏常数Km值的测定，药物对流感病毒神经氨酸酶抑制剂的筛选。化合物MUNANA是神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的代谢产物在355 nm 照射激发下，可以产生460 nm 荧光，荧光强度的变化，可以灵敏地反应神经氨酸酶活性。经过一系列试验参数优化，对1200个样品进行了筛选，有12个样品对甲型流感病毒神经氨酸酶活性产生较好的抑制作用和量效关系。

孙缅恩等^[4]为了寻找作用于中枢神经系统NOS的化合物，应用荧光检测方法建立了适用于高通量筛选的微量快速方法。生物体内NOS催化产生NO的反应需要NADPH作为辅助因子，在产生NO的同时伴随着NADPH被转化为NADP+，使反应体系中NADPH浓度降低。NADPH在350nm波长的激发光照射下，产生波长为450 nm的荧光。反应体系中荧光值的降低速率可以反映NADPH含量变化，因而可以间接反映NOS的活性。实验共筛样品5600个。图1是5600个样品对NOS活性影响的统计结果，样品活性表现为正态分布。

图1、NOS为靶标的样品筛选结果[4]

在荧光强度高通量筛选方法中，需要测定总的荧光强度，筛选化合物的自身荧光和猝灭效应可能会干扰测定结果，在最后的计算中可以作为异常数据除去，达到提高筛选精确性的目的。

2荧光偏振法（FP）

任何荧光分子都可用其“吸收跃迁矩”MA 和“发射跃迁矩”ME 来描述。对于给定分子，其MA 和ME 分别有固定的取向。实验测得的发光强度分子正比于其吸收跃迁矩MA与偏振光取向(P)间夹角T的余弦平方，发射跃迁矩ME与检偏器取向(A)夹角U的余弦平方^[5]。偏振度是发射光强度的一个比值，无方向性，由分子大小决定。原理图如下图2。

图2、药物筛选荧光偏振原理图1[6]

图3、药物筛选荧光偏振原理图2^[6]

设计药物影响G蛋白偶联受体超家族中跨膜受体介导信号转导，分离足够的GPCR，具有完整的构象和可溶性形式的稳定性以及合适的荧光配体的设计是提高FP效率和成功率的关键因素。近年来放射性配体结合试验逐渐被FP取代，用于发现GPCR的新型拮抗剂和激动剂并确定它们的结合亲和力，主要原因是实验成本降低和放射性的健康危害。GPCR的FP测定设置通常在荧光标记的配体与其受体结合后增加FP值。在竞争结合FP测定中，未标记的配体或相互作用的小分子抑制剂的存在导致标记的配体分子的置换，从而增加它们的翻滚运动而这又可以被检测为FP值的降低^[6]。

薛妮娜等^[7]在采用荧光偏振法建立HSP90抑制剂的高通量筛选模型中，以VER00051001为分子探针，依次变化HSP90α浓度和分子探针浓度，4 ℃孵育不同时间，检测荧光偏振值，建立最终选用80 nM分子探针，2. 01μg/mLHSP90α蛋白的抑制剂荧光偏振筛选模型。最终结果显示GA的IC50值为55 nM，NVP-AUY922的IC50值为13nM。具体结果如下图4。

图4、 GA和NVP-AUY922对HSP90α的亲和抑制活性检测^[7]

3荧光共振能量转移法

FRET是指荧光供体受激发后不发射出光子而将激发的能量转移到荧光受体的现象。产生FRET需要满足3个条件：荧光供体和受体之间距离接近(1～10 nm)；供体的发射光谱与受体的激发光谱有重叠；供体和受体之间迁移偶极子的方向平行^[8]。

Klink等在TKI筛选模型中应用了TR-FRET检测技术，其原理如下：将作为供体的稀土元素铽(Tb，激发波长为340 nm，发射波长为495 nm)与ADP单克隆抗体结合，作为受体的荧光素Alexa Fluor 633(发射波长为520 nm)与ADP结合，体系中尚未发生酶促反应时，Alexa Huor 633可借助ADP与ADP单克隆抗体的特异性结合与Tb接近，并发生FRET；当酶促反应发生时，PTK将ATP的磷酸根转移到底物蛋白上，从而生成磷酸化底物和ADP，后者可与荧光素-ADP竞争结合ADP单克隆抗体，因此随着反应的进行，Tb-ADP单克隆抗体与荧光素-ADP的结合减少，致使Tb与荧光素间的能量传递也逐渐减少，Alexa Huor 633发出的荧光强度降低；体系中供试化合物若具有PTK抑制作用，将会阻止酶促反应进行，导致Alexa Fluor 633发出的荧光强度不变或部分降低^[9][10]。原理图如下图5。

图5、TKI筛选模型中TR-FRET的应用^[9]

4时间分辨荧光共振能量转移法和荧光偏振法用于先导化合物筛选的比较实例

Nicolas Wyhs^[11]等利用化合物文库在筛选甲基化DNA和甲基-CpG结合域蛋白2（MBD2）结合的抑制剂过程中，分别采用了时间分辨荧光共振能量转移法和荧光偏振法进行了筛选前期模型优化。原理图如下图6和7。

图6、MBD2与DNA的结合的TR-FRET测定^[11]

图7、MBD2与DNA的结合的FT测定^[11]

分别用两种方法测定荧光标记甲基化DNA和MBD2的相互作用，最终确定时间分辨荧光共振能量转移的高通量筛选条件为30nM寡核苷酸和25nM MBD2，设定阳性和阴性对照，最终荧光偏振法确定的高通量筛选条件为10nM寡核苷酸和200nM MBD2。实验具体结果如下图8。

图8、测定时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）和荧光偏振（FP）MBD2-MBD DNA结合测定的性能（A、B）。使用25nM标记的底物寡核苷酸以384孔格式进行对照处理的TR-FRET和FP测定的性能（C、D）^[11]

泳道1（DMSO载体对照）和泳道3（过量未标记未甲基化的DNA）是阴性抑制剂对照；泳道2是阳性抑制剂对照，由过量的无荧光团的甲基化DNA组成。泳道4是测定阴性对照，显示缺乏与5'-荧光素标记的未甲基化DNA的结合。相对于DMSO媒介物对照（泳道1）计算Z'因子^[12]。结果显示与荧光偏振测定（Z'因子= 0.08）相比，TR-FRET测定显示出显着更好的信噪比（Z'因子= 0.59）。如所预期的，阴性对照（高过量未标记的未甲基化寡核苷酸）在任一测定中均未显着破坏MBD和甲基化DNA的结合。选定TR-FRET进行化合物库1280个化合物的筛选和后期的剂量反应曲线得到最终4个活性化合物^[11]。化合物库初步筛选结果如下图9。

图9、化合物文库筛选图^[11]

总  结

目前，在新药研发过程中，通过荧光检测技术高通量筛选蛋白酶、蛋白激酶及其抑制剂、抗体等小分子已经成为了研究领域的热点。根据具体筛选的条件可以选用荧光技术的一种，同时还可以通过设定参照计算Z和Z'值来选取比较合适的荧光检测方法。虽然荧光技术在HTS中的应用还受到仪器装置、筛选方法等条件的限制。但是荧光检测不会像SPA（闪烁分析法）检测产生放射性污染，也不需要像表面等离子共振法和核磁共振法需要特殊的仪器和设备以及没有并行化不足问题，操作安全度高，可操作性强，获得研究机构的认可程度会越来越强。随着新的荧光检测技术不断涌现，会有更多的新药筛选模型应用于实践，新药的研制周期可能会因此缩短。

参考文献

1、杜冠华.创新药物研究与高通量筛选[J].中国新药杂志,2001,10(8):561

2、彭摇钢等.临近闪烁分析法在高通量筛选中的应用[J].化学进展,2012,24(8):1572

3、曹鸿鹏等.流感病毒神经氨酸酶抑制剂筛选模型的建立和应用[J].药学学报,2002,37(12):930

4、孙缅恩等. 一氧化氮合酶抑制剂和增强剂的高通量筛选[J].药学学报,2002,37(3):161

5、PHOTOGRAPHIC SCIENCE AND PHOTO CHEMISTRY,1998,16(3):274

6、Expert Opin Drug Discovery. 2011,6(1): 17

7、薛妮娜等.采用荧光偏振法建立HSP90抑制剂的高通量筛选模型[J].中国生物化学杂志,2017,2(37):8

8、张怡轩,韩云波.荧光技术在高通量药物筛选中的应用[J].中国药学杂志,2009,41(19):801

9、J Biomol Screen. 2008,13(6): 476

10、Progress in Pharmaceutical Sciences. 2012, 36(1):29

11、Journal of Biomolecular Screening.2014,19(7):1060

12、The Society for Biomolecular screening.1999,4(2):67

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